Молекулярные ножницы: как в России развивается важнейшая технология века
В 2012 году вышла работа, посвященная исследованиям «молекулярных ножниц» — CRISPR-Cas9, нового инструмента для генной инженерии и одного из ключевых научных достижений XXI века. В 2020 году авторы этой работы получили Нобелевскую премию по химии «за метод редактирования генома». Больше 10 лет ученые всего мира активно исследуют возможности CRISPR-Cas9, страны стремятся к глобальному лидерству в генетике, и Россия — не исключение.
ПЯТЬ ЛЕТ АКТИВНОЙ РАБОТЫ
В России давно проводятся исследования редактирования генов и есть проекты, которые готовятся применять редактирование на практике. Например, компания AGCT, резидент «Сколково», разрабатывает метод клеточной терапии ВИЧ-ассоциированных злокачественных опухолей на основе методики TALEN. А вот в сфере CRISPR-Cas9 заметных российских исследователей пока немного.
«В России мало ученых, которые занимаются исследованием CRISPR-Cas9, а условия, в которых они работают, сильно отличаются от условий для ученых в других странах (например, в Китае и США, где активно развиваются и коммерциализируются технологии CRISPR-Cas9).
До недавнего времени в России не было исследований в этом направлении, сейчас ситуация улучшается, но в глобальном масштабе вклад российской науки в этот вопрос очень маленький. В 2021 году от российских ученых было подготовлено лишь 200 статей на тему “молекулярных ножниц” — из 20 000. И часть из этих работ — продукт моей российско-американской группы».
Ведущий научный сотрудник лаборатории мутагенеза ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» Светлана Смирнихина рассказывала, что исследования в области редактирования генов в России проводятся не так успешно, как в США или Китае, из-за долгих сроков поставок приборов, реактивов и других ресурсов. А еще некоторые ученые считают, что ситуацию усложняет запрет на патентование таких технологий. В частности, на патентование модификаций эмбриона.
Здесь барьером становятся этические вопросы, которые остро стоят не только в России, но и во всем мире. Все еще неясно, насколько на самом деле безопасны «молекулярные ножницы», не появятся ли спустя время новые мутации в «отредактированном» организме — возможно, даже более страшные, чем заболевание, которое вылечили.
Активная работа над CRISPR-Cas9 в России ведется с 2018 года. Тогда премьер-министр Дмитрий Медведев утвердил федеральную программу развития генетических технологий до 2027 года. В 2019-м появился Центр редактирования генома, но только для теоретического изучения вопроса — по мнению директора «Медико-генетического научного центра» Сергея Куцева, технология не самая перспективная, просто «выглядит красиво». С позиции реальной применимости Куцев более высоко оценил эктопическую экспрессию гена.
В том же 2019 году Госдума начала исследовать правовое регулирование этой темы в разрезе репродуктивных технологий. Главный вопрос: можно ли редактировать ДНК эмбрионов? В конце 2019-го российский ученый Денис Ребриков планировал отредактировать ДНК яйцеклетки для лечения наследственной глухоты. Имплантировать их матери он смог бы только после разрешения Минздрава, но в ведомстве были против.
А еще ученый собирался опубликовать результаты экспериментов по тестированию способности CRISPR восстанавливать ген, связанный с глухотой, — GJB2. Это первый эксперимент такого рода в мире, кроме российских ученых пока никто не пытался редактировать GJB2 у человека. Но заметных успехов Ребриков пока не добился.
Следующая важная веха в российской геномике — развитие геномных центров. В 2020 году «Роснефть» стала главным технологическим партнером проекта по созданию трех геномных центров мирового уровня, на которые в федеральном бюджете было запланировано выделить 12,2 млрд рублей.
Помимо этих центров исследованиями при поддержке государства занимаются и другие организации. Например, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. В последнем ученые работают над созданием редакторов генов нового поколения. Более быстрых, чем Cas9, при этом более точных.
А в Институте биологии гена РАН на мышах нашли способ лечить миодистрофию Дюшенна, от которой страдают тысячи людей. В этом помогли как раз «молекулярные ножницы». По словам ученых, такую генную терапию можно было бы использовать на человеке, но редактирование генов in vivo (то есть у конкретного пациента) запрещено.
В рамках отдельных российских лабораторий тоже ведутся исследования. В Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН ученые изучают укладку ДНК и ее влияние на экспрессию генов, с помощью CRISPR-Cas9 создают мышей-«мутантов»: например, для вирусологов делали восприимчивых к ковиду мышей, чтобы тестировать вакцины и лекарства.
Важный момент: по словам ученых, сейчас CRISPR-Cas9 почти в 10 раз дешевле других инструментов редактирования генов.
ЧТО БУДЕТ ДАЛЬШЕ
Российские ученые регулярно принимают участие в развитии направления редактирования генов в рамках международных сообществ: 70 российских исследователей являются членами HUGO — Международной организации по изучению генома человека. Это международное сотрудничество с 2020 года осложнялось пандемией, а в 2022 году научное сообщество столкнулось с санкциями. В новой ситуации наука в России фактически изолируется, хотя западные ученые просят не прекращать международного сотрудничества. И совместная работа действительно продолжается, пусть и с ограничениями.
В марте 2022 года Минобрнауки приняло решение временно не требовать от ученых публикаций в международных базах данных и участия в зарубежных конференциях. Раньше это было обязательно для отчетов по проектам и грантам. В новых условиях ведомство решило подготовится к возможным массовым отказам в публикациях для российских ученых — но худшего не случилось.
«Отмечаются отдельные случаи, когда журналы отказывают в публикации работ российских ученых. Есть примеры, когда журнал согласен опубликовать статью по результатам рецензии, но отказывает по причине того, что невозможно оплатить публикационный процесс. Но это отдельные случаи, и массового отказа от публикаций российских авторов в зарубежных журналах не наблюдается».
Однако вести научную работу все равно стало сложнее. Глобальная база данных со сведениями о публикациях в научных журналах и патентах (Web of Science) в 2022 году приостановила доступ для российских пользователей. Для российских ученых возникли сложности и с грантами за рубежом. В марте 2022 года UK Research and Innovation (Государственное агентство исследований и инноваций Великобритании) приостановило выплаты грантов для проектов, в которых заняты ученые из России.
Еврокомиссия отказалась заключать новые контракты с российскими организациями в рамках программы Horizon Europe (ключевая программа финансирования исследований и инноваций ЕС), приостановила платежи по текущим договорам и стала пересматривать активные проекты. Французская научная организация CNRS тоже ограничила партнерство с российскими учеными.
Глобальной изоляции нет, но отказы в сотрудничестве — есть. О них говорят и сами ученые: дочь доцента физического факультета МГУ Владимира Сурдина, биохимик, должна была по приглашению ехать работать за рубеж. Но приглашение отозвали, пояснив, что «вы хороший специалист, но у нас нет морального права».
Как поясняет Дмитрий Карпов, один из основных вызовов для быстрого развития генетических технологий в России — дефицит информации и опыта: «Есть нехватка квалифицированных специалистов, а сегодня еще и обязательный для индустрии обмен международным опытом усугубляется сложившейся ситуацией. Все это, вероятно, осложнит подготовку кадров в будущем».
Санкции также создали дефицит расходников вроде реагентов и оборудования для лабораторий — все это было преимущественно зарубежным. Возможной альтернативой становятся поставщики из стран Азии, но не всему можно быстро найти замену.
Острее всего стоит проблема обеспечения исследователей качественным и надежным оборудованием. Если ученые-теоретики еще как-то справлялись, то экспериментаторы уже в марте 2022 года жаловались, что закончились реагенты и запчасти для оборудования.
«Остается полагаться на смекалку российских мастеров, искать в продаже китайские аналоги, а также думать о переходе на имеющиеся отечественные решения, которые, кстати, есть и весьма достойно работают. В нашей лаборатории наряду с зарубежными амплификаторами, регистрирующими сигнал в режиме реального времени, используются и отечественные приборы, и они еще ни разу не подвели. Некоторые сложности в использовании все же были, но на поверку оказывалось, что они связаны только с программным обеспечением, а “железо” работает безупречно».
Пока что наука в целом и направление генетических технологий в частности даже под санкциями продолжают работать и развиваться дальше. В Институте химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) Сибирского отделения РАН ученые создают модифицированные направляющие РНК, которые нужны для работы CRISPR-Cas9 и других инструментов редактирования генома. Модифицированные направляющие улучшают свойства «молекулярных ножниц» — повышают их точность и снижают токсичность для клеток. Статья об исследовании опубликована в международном журнале The CRISPR Journal в конце 2022 года, а само исследование проводится при поддержке Российского научного фонда.
Ранее ученые того же ИХБФМ получили патент на модифицированную РНК, которая «отключает» CRISPR-Cas9. Это еще один шаг к повышению точности лечения при помощи редактирования генов. Как поясняют сами сотрудники института, чтобы исправлять ошибки в геноме, «ножницы» нужно вовремя «включать» и «выключать», и вторая задача наконец решена. Дальше ученые планируют найти возможность переключать активность CRISPR-Cas9. Эта разработка будет важна для ситуаций, когда нужно редактировать отдельные молекулы ДНК в организме, и поможет в дальнейшем создавать лекарства от некоторых наследственных заболеваний.
НО ЕСЛИ К РЕДАКТИРОВАНИЮ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА РОССИЙСКИЕ УЧЕНЫЕ ПОКА ТОЛЬКО ОСТОРОЖНО ПРИБЛИЖАЮТСЯ, ТО В ЖИВОТНОВОДСТВЕ УЖЕ НЕСКОЛЬКО ЛЕТ ПРОВОДЯТСЯ УСПЕШНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ
В 2022 году ученые Федерального исследовательского центра животноводства им. академика Л. К. Эрнста создали первого в мире клонированного гибридного ягненка, у которого есть гены диких животных (горного дикого барана). А в 2023 году клонированная корова — плод труда ученых того же исследовательского центра — впервые принесла потомство.
«Больших проблем с финансированием в проектах, связанных с редактированием генома, в рамках геномных центров и грантов РНФ мы не наблюдаем, — говорит Дмитрий Карпов. — По крайней мере нет прямых данных от Министерства образования об уменьшении финансирования программ, связанных с развитием генетических технологий в России. Более того, мы видим повышенный интерес фарминдустрии к отечественным разработкам. У нас есть сильные коллективы, уверенно владеющие генетическими технологиями и участвующие в популяризации знаний об этих технологиях в Российском научном обществе».
Ученый также полагает, что у российских исследователей сейчас есть практически все, чтобы провести нужные эксперименты по редактированию генов, ответить на научные, медицинские и практические вопросы, ради которых и затевалось это редактирование, а также сообщить о полученных результатах в престижных зарубежных журналах.
ДЛЯ ТЕХ, КТО ДОЧИТАЛ И ХОЧЕТ ПРОДОЛЖЕНИЯ
На глобальном рынке геномики сегодня, по оценкам аналитиков, есть три самых перспективных направления. Это генетический анализ и секвенирование (определение аминокислотной или нуклеотидной последовательности белков, ДНК и РНК), генетическое тестирование и диагностика, а также генетическое редактирование. Последнее связано как раз с технологией «молекулярных ножниц».
Развитие CRISPR-Cas9 важно для прогресса в биотехнологии и фармацевтике, потому что «молекулярные ножницы» позволяют изменять гены in vivo (то есть молекулы редактирования вводятся сразу в пациента) с максимальной точностью, простотой и при этом низкими затратами (относительно, например, ZFN — другой технологии редактирования генов).
По мнению аналитиков, CRISPR-Cas9 можно использовать в разработке новых лекарств, сельскохозяйственных продуктов и генетически модифицированных организмов, для борьбы с болезнями и вредителями. Более того, новый метод может изменить лечение наследуемых генетических заболеваний. Именно в понимании наследственных болезней, которые раньше считались неизлечимыми, исследователи CRISPR-Cas9 продвинулись сильнее всего.
Относительно других генетических технологий (ZFN, TALEN) CRISPR-Cas9 проще в реализации. По словам биолога Федора Урнова, первый этап редактирования теперь доступен даже старшеклассникам. В ZFN и TALEN для каждой новой мутации нужно конструировать новый белок, тогда как в CRISPR-Cas9 требуется единственный белок, а РНК-гид можно легко и быстро или создать, или купить. Поэтому работа с этим инструментом легче и быстрее.
За 10 лет ученым всего мира удалось сделать немало с «молекулярными ножницами». К концу 2022 года пройдена первая фаза испытаний безопасной клеточной терапии рака: результаты опубликованы в Nature. Также на основе CRISPR-Cas9 разработан новый инструмент редактирования генов PASTE: благодаря ему можно внедрять в геномы фрагменты ДНК длиной несколько тысяч нуклеотидов. То есть PASTE — практически усовершенствованный CRISPR-Cas9. Новый инструмент может быть полезен для замены дефектного гена, отвечающего за развитие кистозного фиброза, и для лечения заболеваний крови, связанных с мутациями: например, гемофилии.
В изучении CRISPR-Cas9 доминирует Северная Америка. В частности, здесь выделяется Intellia Therapeutics: в 2021 году компания предоставила клинические данные, показавшие безопасность и эффективность «молекулярных ножниц» в терапии амилоидоза ATTR — редкого смертельного заболевания, при котором печень вырабатывает аномальные белки (TTR). Они накапливаются в организме и вызывают осложнения.
В Intellia на базе «молекулярных ножниц» создали лекарство NTLA-2001, которое инактивирует ген TTR в печени и препятствует выработке аномального белка. Сначала NTLA-2001 изучали на пациентах с полинейропатией. В 2022 году его также проверили у людей с ATTR с кардиомиопатией. Изучение лекарства продолжается, глобальное ключевое исследование запланировано на конец 2023 года.
Другая значимая компания в области генетического редактирования — швейцарско-американская CRISPR Therapeutics, совместно с Vertex она разрабатывает препарат (Exa-cel) для терапии серповидноклеточной анемии и трансфузионной бета-талассемии. Сейчас препарат проходит клинические испытания для оценки эффективности и безопасности. Также CRISPR Therapeutics в конце 2020 года получила грант от фонда Билла Гейтса на продвижение терапии редактирования генов для лечения ВИЧ.
Помимо этого аналитики Zion упоминают Thermo Fisher Scientific (США), Merck KGaA (Германия), GenScript (Китай) как компании, занимающиеся самыми активными исследованиями CRISPR-Cas9. Помимо Северной Америки перспективным регионом называют Азиатско-Тихоокеанский.